犬细小病毒病学说
犬细小病毒病（Canine Parvovinis disease）是由犬细小病毒（Canine Parvovirus）引起的犬的一种接触性急性致死性传染病。病的特征是剧烈呕吐、出血性腹泻、血液白细胞显著减少，或非化脓性心肌炎。本病常发生于幼犬。
病原：犬细小病毒（CPV）属于细小病毒科小病毒属的DNA型病毒，电镜下发现病毒粒子直径为20—22nm，呈20面体对称，无囊膜，在氯化铯中的浮密度为1.43g/cm3。
病毒对各种理化因素有较强的抵抗力，在pH3—9和56℃的条件下，至少能稳定1小时，对乙醚、氯仿等脂溶性溶剂不敏感，但对福尔马林、B-丙内酯、氧化物（漂白粉、PP粉）、紫外线等较为敏感。0.5%的福尔马林液能很快使其灭活。
犬细小病毒在猫、犬、牛、猴、浣熊和貂等动物细胞培养中均能生长，并产生大量的嗜喊性核内包涵体。这种包涵 体在接种临床病料（如粪便）之后的36小时即可出现。
血凝试验（HA）时，犬细小病毒能在4℃条件下凝集猪和恒河猴的红细胞，而不凝集其它动物和人的O型红细胞，犬细小病毒凝集猪红细胞的特性与猫的细小病毒凝集猪红细胞相似，但两种病毒对猴和猫的红细胞凝集试验却不同，通过血凝抑制和血清中和试验可以证明犬细小病毒与猫科动物细小病毒不同，因为犬细小病毒与猫的细小病毒有相似的抗原性，两者存在着血清学交叉反应。犬细小病毒有2型、2a型和2b型，2型用来制作疫苗以及单克隆抗体，可以保护2型和2a型。但是2型和2b型之间没有交叉保护力。
流行病学：犬是本病的主要感染者，特别是断奶前后的幼犬最易感。其它犬科动物如狼、狐、浣熊等动物也能感染。患病动物是本病的主要传染源。病毒随粪便、尿液、呕吐物及唾液排出体外、污染食物、垫料、食具和周围环境、康复犬的粪便可长期带毒。健康犬主要是摄入污染的食物和饮水或与病犬直接接触而经消化道感染。不同年龄、性别、品种的犬均可感染，一年四季均可发生。
发病机理：到目前为止，对犬细小病毒感染的病理发生尚缺乏深入研究。大部分学者认为：犬心肌炎和胃肠炎两种综合征是同一病毒的不同感染形式，3—4周龄的小犬患急性心肌炎，而成年犬和10周龄以上的犬患肠炎综合征。原因是哺乳小犬心肌迅速生长，而肠上皮更新很少，并且心肌细胞在出生后是不分裂的，小犬心肌中的卫星细胞对细小病毒的复制可提供合成DNA功能的需要。
症状：根据临床症状可分为两型：即心肌炎和肠炎型。
肠炎型：又称出血性肠炎型，潜伏期7—14天，主要表现为急性出血性腹泻、呕吐、沉郁、白细胞显著性减少等症状。患犬精神沉郁，食欲废绝，呕吐，体质迅速衰弱。不久，发生腹泻，呈喷射状排出，粪便呈黄色或灰黄色，覆盖有多量粘液和伪膜，随后粪便呈蕃茄汁样，带有血液，发出特别难闻的腥臭味，病犬迅速脱水，眼窝深陷，皮肤弹性减退。最后因水、电解质平衡失调，并发酸中毒，常在腹泻后1—3天内死亡。体温升高到40—41℃，但也有体温始终不高的。有的病犬腹泻可持续1周多。血液学检查，白细胞总数明显减少，尤其是在发病的第5—6天 最为明显，常在3.0×109/L以下，血清总蛋白量下降至4.2—6.6mg%，红细胞压容为45—71，平均在50左右，转氨酶指数升高。发病率为20%—100%，死亡率为10%—50%。
心肌炎型：此型多见于4—6周龄的幼犬。发病的特征是临床症状未出现就突然死亡，或者是出现严重的呼吸困难之后死亡。病程稍长的病例，发病初期精神尚好，或仅有轻度腹泻，常突然病情加重，可视粘膜苍白，病犬迅速衰竭，呼吸极度困难，心区听诊明显的心内杂音，心律不齐，常因急性心力衰竭而突然死亡。死亡率为60%—100%。
病理变化
肠炎型：小肠中段和后段肠腔扩张，浆膜血管明显充血，浆膜下出血变为暗红色，肠内容物水样暗红色，肠系膜淋巴结肿胀、充血。有些病例，整个小肠表现充血和明显出血。组织学变化主要见于空肠、回肠，肠绒毛明显萎缩，肠腺消失，甚至粘膜严重剥脱，肝细胞局灶性坏死，少数动物肝细胞和胆管上皮细胞中有嗜酸性核内包涵体。
心肌炎型：肺水肿，由于局灶性充血和出血，肺表面色彩斑驳。心脏扩张，两侧心房、心室有界限不明显的苍白区，心肌或心内膜有非化脓性坏死灶，心肌纤维严重损伤，出现出血性斑纹。
诊断：根据流行病学、临床症状和血液学、病理解剖和病毒学检查，可以确诊。常用的实验室诊断方法有：
1、细小病毒试纸快速诊断法：取病犬粪便约1g左右盛入干净消毒的试管中，加生理盐水约5ml，充分振动静置5分钟（或离心），取试纸条将带有max线箭头一端插入粪便上清液中（注意粪便液面不要超max标志线）约15秒后取出平放桌面上，5分钟后观察结果，呈现一条红线为阴性，两条红线为阳性。
2、电镜与免疫电镜检查：先将粪便用氯仿处理，然后以5000转/分离心10分钟，取其上层液，滴于铜网上，用磷钨酸染色后于电镜下观察。病初可见到大小均一、散在的病毒粒子，感染后期，由于肠道出现肠粘膜分泌性抗体，使病毒呈聚集状态。
为了鉴别粪便中的致病性细小病毒与非致病性细小病毒，可进行免疫电镜检查，细小病毒与非致病性细小病毒无抗原亲缘关系，当非致病性细小病毒与细小病毒免疫血清作用时，不产生聚集状态，而细小病毒与细小病毒免疫血清能发生聚集。
3、血凝试验：用10倍稀释的粪便，5000转/分离心后，用猪红细胞在4℃条件下做直接血球凝集试验，可作出简单的快速诊断。
预防：犬细小病毒可用犬源或猫源细胞灭活苗或弱毒苗免疫。灭活苗比较安全需接种两次，间隔为3—4周，也可用细小病毒甲醛灭活苗接种，2月龄或稍大的犬，免疫力可耐过强毒攻击持续时间9个月。目前普遍使用的是犬用五联苗或犬用六联苗。免疫程序是：小犬两月龄时免疫第一次，间隔两个星期免疫第二次，再间隔两个星期免疫第三次。成年犬每年免疫两次。
治疗：无特效治疗方法，常采用对症治疗、支持疗法、控制继发感染和中草药治疗。其具体方法可采取以下措施：
1、特异疗法
2、支持疗法
3、对症治疗
4、控制继发感染
5、中药疗法
犬细小病毒病病原分离与鉴定
犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。近年来，该病对养犬业造成了极大的威胁，严重地影响了我国警（军）犬事业的发展。该病毒在1977年首次由Eugster和Nairn从患腹泻的病犬粪便中分离成功。随后，在世界许多国家陆续报道了该病的流行，并分离出病毒。自1983年开始，我们对本病进行了一系列的研究。于1986年和1987年分别从同一地区的患犬粪便中分离出两株犬细小病毒，定名为CPV—GN1和CPV—GN2毒株，并对该病毒进行了系统鉴定。现将结果报告如下：
材料和方法
一、主要试剂设备
1、细胞培养粉： MEM（日本产）、BME（美国产）、水解乳蛋白（英国产）。
2、胰蛋白酶：进口分装（美国产）
3、5一溴脱氧尿核苷（瑞典产）。
4、乙醚、氯仿等。
5、96孔微量血凝板、0.O25ml金属稀释棒、96孔细胞培养板、微量振荡器、二氧化碳培养箱等。
6、①毒株：GN1与 GN2毒株为本试验分离鉴定毒株，已传至第 15代。②对照毒株：美国 CPV74一1529毒株（CPV—A，特产研究所提供）；西德 CPV诊断液（血凝素）和猫泛白细胞减少症病毒（FPV），均由长春兽大兽医微生物教研室和南农大传染病教研室提供；貂肠炎病毒（MEV），由长春兽医大学传染病教研室提供。
7、抗血清：①抗GN1毒殊的高免血清，获自按常规免疫的家兔；②德国产抗CPV标准高免血清，由南农大兽医微生物教研室提供；③犬抗 CPV阳性血清（CPV一ch1）和豚鼠抗 CPV阳性血清（CPV一ch2），兔抗MEV阳性血清，均由长春兽医大学研究所病毒室赠送，抗FPV阳性血清，由南农大传染病教研室提供。
8、试验用细胞：CRFK、NLFK、A72细胞系西德引进，由南农大兽医微生物教研室提供。F81由中监所和长春兽医大学传染病教研室提供。MDCK、Vero、MDBK、MA104、BHK、IBRS—2细胞由长春兽医大学传染病教研室提供。
9、试验犬为 6O日龄的断乳犬，经采血样作血凝抑制试验证明，其 HI抗体滴度低于 20倍，并驱虫（口服左旋咪唑）。在攻毒前一周预先测温，采粪样（供作血凝对照）和血样供检。
10、HA缓冲液与细胞单层用 Hauk’s液:0.005M PH7.O PBS，②Hauk’s液。
二、试验方法
（一）、病毒的细胞分离培养
1、粪便标本的制备取患犬的早期粪便，以PBS作1O倍稀释，振荡数分钟以2500转／分离心15分钟，吸取上清9份，加入氯仿1份。振荡混匀后，置4摄氏度感作过夜；再以 300O转／分离心15分种，按每毫升上请加1000单位或微克的青、链霉素，4摄氏度感作两小时后，冻存，以此作为病毒分离的材料。
2、分离病毒 将接种材料按细胞培养量的 1／1O同步接种猫肾传代细胞（ GN1株）或犬肾传代细胞（ GN2株），于3 7摄氏度静置培养，并逐日观察细胞病变（CPE），历时3－5天。培养液为1O％小牛血清，维持液为2％小牛血清，培养过程中的pH值以74％NaHCO3 来校正。
（二）病毒的鉴定
1病毒的血凝（HA）特性
①血凝效价的测定 接改良的Appel等描述的方法进行HA检测。稀释液为PBS；血凝素（抗原）：细胞培养物，经冻融三次；从0.75-l％的猪红细胞悬液为 HA指示细胞。以能使0.5％红细胞凝集的样本最高稀释倍数的倒数为 HA滴度。 ②血细胞凝集谱测定 取能凝集猪红细胞的培养物作为待测样品，按表2所示方法在同样条件下与恒河猴、猪、猫、马、牛、绵羊、山羊、犬、家兔、豚鼠、地鼠、小白鼠、鸡、鹅、人一O型的0.5％红细胞进行HA试验，观察病毒液对不同种类动物红细胞的凝集特性。
2、病毒的细胞敏感谱试验
本试验选择猫肾传代细胞系（CRFK、NLFK、F8l）、犬肾传代细胞系（MDCK）、犬纤维瘤细胞系（A72）、猪肾传代细胞系（IBRS）、地鼠肾细胞系（BHK）、绿猴肾细胞系（Vero）、罗猴肾细胞系（MA104）、牛肾细胞系（MDBK）等多种细胞作为接种对象，分别接种已适应在猫肾细胞上HA滴度≥128x的第15代细胞培养液（冻融三次）。按常规方法进行同步或单层吸附接毒，37℃静置培养24小时后，换维持液（单层接毒不换液），逐日观察CPE，4－5天收获冻融，再以同样方法连传3—5代，以出现CPE和HA作为感染指标。
3、病毒的理化学特性鉴定
按Hitoshi等和殷震等描述的方法进行。以5一溴脱氧尿核苷（BUDR）代谢抑制试验检查两分离毒株的核酸型，以常规方法检查病毒对2O％乙醚和5％氯仿的敏感性，对0.5％胰蛋白酶的耐受力，以及病毒的抗酸（PH3.0）能力和耐热（56℃30分钟、80℃10－120分钟）能力。
4、病毒的形态学观察
将猫肾传代细胞培养物快速冻融三次，300O转／分离心20分钟，除去细胞碎片，取上清以2％磷钨酸盐进行负染，在J－2型电镜下进行病毒形态观察。利用含毒上清液与等量的CPV阳性高免血清混合，于37℃感作60分钟，最后用电镜载物铜网沾取病毒一血清复合物负染，在电镜下观测桥联作用。
5、病毒的交叉血凝抑制试验。
本试验在V型血凝板上进行。以稀释棒法取不同来源的血清作横排2×系列稀释。每一血清稀释两横列，一横列加 4－8单位抗原，一横列加PBS。充分振荡后, 37℃后感作一小时，最后每孔加入两滴（0.025ml／滴）PBS配制的猪红细胞悬液。充分振荡混匀后，干4℃感作2－4小时。在对照成立的情况下，以本应出现凝集组但被完全抑制的最高血清稀释度的倒数来作为HI的判定。
6、病毒交叉中和试验。
当F81在96孔细胞微量培养板上长成近7O％的单层后，取各自以4×连续横行排列稀释的免抗CPV－GNl高免血清，犬抗CPV一ch1免疫血清和豚鼠抗CPV一ch2免疫血清，统一加入等量200个TCID50的CPV一GNl培养物，37℃感作一小时后，在微量板上进行中和试验。同时设血清、病毒与健康细胞对照，于5％ CO2(37℃）培养箱中培养 5—7天，每天观察细胞病变和收毒测 HA滴度，其结果按Reed—Muench氏法计算其中和效价。
7、GN病毒株动物复归试验选择8头2月龄左右的健康幼犬，攻毒前先对其进行体温、白细胞总数、粪便HA滴度、血清中抗CPV的HI抗体水平等检查。攻毒时随机将其分为两组，一组2头，口服G N1株病毒培养液 4ml／头；另一组 6头经口接种 GN2株 8ml／头（均为15代细胞适应毒）。接种后，逐日测温以及采粪样作HA试验，于接种后的第 3和第 7天，分别采血样作白细胞计数，于接种后的第 7和第 14天分别采血样测HI效价。每组第5天分别捕杀1头犬，并对自然、人工致死的试验犬分别收集脾、心、肝、肺、肾、小肠、肠系膜淋巴结等器官的样品，置低温保存，按常规病毒分离方法处理病料，接种F81细胞上，以观察回收样品能否出现CPE现象和HA活性。
结果
（一）病毒的分离
1、 CPV—GN1株先在 F81细胞上适应二代，第一代接毒细胞无明显细胞病变，但HA效价（ 64×左右）。从第二代开始，约在接种后24—26小时出现明显的细胞病变，以细胞圆缩，胞浆收缩或聚集成网状为其主要特征，以后病变细胞呈葡萄串脱落。取其二代培养物快速冻融三次后转入CRFK细胞上进行第三代培养。
2、CPV—GN2株先在犬肾细胞上适应一代，接种细胞虽无明显CPE，但HA则为128×，第二代接种猫肾传代细胞（CRFK）在CRFK细胞上连传三代后即出现明显的细胞病变,其HA达128×以上。
3、血凝范围测定在4℃反应条件下,PBS的PH在6.0－7.4范围内，CPV一GN1株能很好地凝集猪和恒河猴红细胞，也能凝集马和猫的红细胞，而不能凝集其它动物的红细胞。在 22℃、 37℃环境中，其HA敏感性降低，在2－3小时后病毒可以RBC上解脱下来。经比较，FPV的HA活性对温度要求比较严格，其温度仅限于4℃，PH值限于6.0一6.4范围，凝集红细胞的能力以猪、恒河猴及马的红细胞最明显，不能凝集猫等其它动物的红细胞。
（二）病毒对不同细胞的敏感（细胞感染谱）试验
本试验将 GN1和 GN2两株病毒分别在1O种细胞上同步连续培养 5代，并逐代观测 CPE与HA活性。结果表明，两株毒均可在三种猫肾传代细胞（CRFK、F81、NLFK）上增殖，也可在犬纤维瘤细胞系（A72）上增殖。在MDCK细胞上，同步接种连传5代或单层吸附接种连传3代，均未发现明显的病毒增殖现象。两毒株MDCK、MA104、Vero、IBRS、BHK等细胞上既无CPE，其培养液亦无HA活性。
（三）病毒的理化学特性
两分离毒株的理化学特性试验结果表明，BUDR能抑制GN1和GN2毒株的增殖，证明分离毒的核酸是DNA型。两毒株都能抵抗20％乙醚4℃24小时、5％氯仿4℃1O分钟、PH3．0 37℃2小时和0.5％胰蛋白37℃1小时处理。也能抵抗56℃30分钟、80℃1O分钟的高温处理；80℃10—3O分钟病毒部分失活，80℃6O分钟内病毒全部失活。
（四）病毒的形态观察结果
将病毒悬液敷子铜网上，经2％磷钨酸负染镜检，在1个视野见有散在的病毒颗粒。在此基础上又进行了免疫电镜观察（即在病毒液中加等量的抗 CPV免疫血清,37℃ 6 O分钟后将样品沾于铜网上，磷钨酸负染），在电镜下均可．见到凝集成团的桥联现象，病毒颗粒大小均一。病毒颗粒有电子密度相差悬殊的空心和实心两种形态存在。多为圆形，无囊膜，直径约20－22毫微米。
（五）病毒的单相交叉中和试验
用已知的犬抗 CPV－Chl（长春株）和豚鼠抗 CPV— Ch2株，以及免抗 CPV— GN1株的血清与 100个TCID50的 CPV－ GNl进行单相交叉中和试验。结果按 Reed－Muench氏法计算表明，三种血清都能与 CPV－ GNl株病毒产生中和反应；中和效价均为1:256。
（六）病毒的交叉血凝抑制试验
用已知的cpv抗血清（抗cpv－G西德株、犬抗cpv－CN和豚鼠抗cpv—Ch2），同时对GN和GN2（4一8单位）分离毒株进行 HI试验。并以免抗 CPV－GNl株免疫血清与美国标准毒株（CPV－A）做交叉血凝抑制试验。为比较分离毒株与 FPV、MEV抗原关系，试验中还将分离毒与抗 FPV血清、抗 MEV血清进行交叉 HI试验。结果表明：CPV—GN1株与本源抗血清 HI效价为 1280×，同源美国、西德标准毒株和国内毒株的HI效价为640—1280×，相差1个滴度以内。而与异源毒株（FPV、MEV）交叉HI效价为80－320×，相差4个滴度以上。
（七）病毒的动物回归试验
以GN1口服接种2头小犬，GN2口服接种6头小犬，试验接毒后的临床观察以及粪便、血清、白细胞检测结果详见表6。结果表明：两毒株在接种后2一7天，试验犬陆续表现短暂的温和型临床症状。接种后第2天有1头犬出现严重的呕吐，大便带血，体温升高（40.3℃），食欲废绝，精神沉郁，在接种后第3天死亡。病理解剖发现小肠出血，粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀、出血；肠腔内有血样粪便。两毒株接毒后 3天， 4／7的犬白细胞减少且临床症状基本消失, 2—14天，粪便中均有病毒排出。接种后7天,HI效价平均为 320×；到第 14天升达 64O－1280×。
于接种后5天，取自然死亡犬和捕杀抽验的两头犬（每组1头）的脾、肾、肠系膜淋巴结、小肠等脏器，研磨制成10×乳悬液，冻融数次后离心，取上清接种F81细胞，均成功地分离到病毒。在接种后的2—5天收集的粪便中也分离出病毒。
讨论
一、关于GN病毒株的一般性状
本课题从患出血性肠炎病犬粪便中分得CPV一GNl和CPV－GN2两毒株，经生物学特性和理化特性鉴定，与国内外描述的CPV基本一致。证实我们分离的两株病毒属于小DNA病毒科、细小病毒属的成员之一。
关于CPV对MDCK细胞的敏感性,Siegl和Maehgub的研究认为，各种MDCK细胞株对CPV的感染性有一定差异。据报道，有的毒株在某些MDCK细胞株上（C株）呈钝感甚至不增殖。本试验发现，病毒在MDCK细胞上，无论是同步接种速传5代或单层接种连传三代，均未见有病毒的增殖和细胞病变。对此我们分析有以下几种可能；①所用的MDCK细胞株对CPV缺乏易感性；②病毒在MDCK细胞上的传代代次偏低；③分离毒株在培养和细胞适应过程中交叉培养史不同。从实验程序来看，我们分离的毒株因在猫肾细胞上已适应15代，待转到MDCK细胞上，初始几代培养中暂不适应；④病毒毒株间的差异，如同Eugstev（1980）、Appel （1979）等报道的CPV对Vero细胞敏感性不一样，GN病毒本身就对MDCK细胞缺乏易感性。上述推测，尚待进一步研究证实。
二、分离毒株与已知毒株，以及FPV、NEV之间的血清学关系
在本试验中，交叉血凝抑制试验的结果表明，两分离毒株均能与 FPV、MEV产生交叉 HI反应，但 3种病毒的抗血清与同源病毒反应测得的HI效价，比与异源病毒反应测得的HI效价，高4个滴度以上，这些结果不仅证明两分离每株与其他学者报道的CPV结果一致，与FPV、MEV有相关的抗原性；而且也说明3种病毒抗原与抗体的亲和性以同源为高；这种亲和性与制备抗体的动物种类可能无关。
三、关于细小病毒的致病性
许多学者认为:CPV人工感染犬只引起温和型临床变化。在本试验中，以两株分离病毒人工感染8头犬后，仅有1头在接种后2天出现典型的临床症状，并于第3天死亡。其它7头犬仅表现短暂的温和型症状，且于第7天恢复正常。从自然死亡犬和在第5天捕杀犬的脏器中，以及从接种病毒后第2－5天的粪便中，均回收到了细小病毒。以上结果与国外报道相似。与此相比较，以病料（自然感染犬的脏器和粪便提取物）回归动物，可导致与自然感染相类似的临床症状。故在一些CPV疫苗效力试验中，多使用自然病犬含毒脏器悬液作为试验动物的攻毒材料。
犬细小病毒高免血清
犬细小病毒是犬的常见病，尤其是刚从狗贩那里买回的幼犬，发病率最高。犬细小病毒病目前无特效治疗方法，早期发现及时使用高滴度的犬细小病毒高免血清，同时采用对症治疗，支持疗法，可有效控制继发感染。在临床工作中，一些宠物医院应用这种方法已将大量病犬治愈。由重庆市友好宠物医院和吉林长春原兽医大学共同研制的犬细小病毒高免血清，是采用犬细小病毒细胞培养纯化物，对健康成年犬进行多次强化免疫，心脏采血分离纯化而成。内含针对犬细小病毒的高效价抗体。对犬细小病毒综合治愈率达90%，对犬瘟热病早期治疗也有较好的疗效
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